江苏大学
硕士学位论文
PTD-△miniDBD融合蛋白体外功能的研究以及PTD-Foxp3融合蛋
白对小鼠T淋巴瘤细胞的增殖及细胞凋亡的影响
姓名:招倩倩
申请学位级别:硕士
专业:免疫学
指导教师:邵启祥
20100610
江苏大学硕士学位论文
缩略语
bp
cDNA
CD
DNase
DC
EUSA
EDTA
eGFP
GFP
FOXP3
H。
lFN
lPTG
kb
kDa
mRNA
mFOXP3
NFAT
OD
PAGE
PBS
PCR
PMSF
SDS
TCR
Treg
英文缩写索引
英文名称
base pair
complementary DNA
Cluster of differentiation
Deoxyribonuclease
Dendritic cells
Enzyme·Linked Immunosorbnent Assay
Ethylene diamine tetraacetic acid
Enhanced green fluorescence protein
Green fluorescent protein
Forkhead box p3
Intefleukin
IntefferOll
Isopropylthio—B—D galactoside
Kilobase
Kilodalton
Messenger RNA
MOtlSe
Nuclear factor of activated T cells
Optical density
Polyacrylamide gel electrophoresis
Phosphate·buffer saline
Polymerase chain reaction
Phenylmethyl sulfonyl fluoride
Sodium dodecyl sulfate
T cell receptor
Regulatory T cells
学术诚信声明
本人郑重声明:所提交的学位论文,是本人在导师的指导下独立完成的。
除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发
表或撰写过的成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文
中以明确方式标明。本人完全意识到违反本声明的后果由本人负担。
学位论文作者签名:翻和商
日期:O.ot o.口易.,)
学位论文版权授予书
本学位论文作者同意学校保留该学位论文并向国家有关部门或机构送交
论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权江苏大学可以
将本学位论文的全部内容或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用
影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。
本学位论文属于
保密v歧,
不保密0
学位论文作者签名:粥‘菊百菊
本授权书。X
导师虢冽声彳
签字日期: 夕口f口.ob·,j 签字日期: 夕口,口.D易-,’
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第一篇
PTD.AminiDBD融合蛋白体外功能的研究
THE RESEARCH FoRTHE FUCTIoN oF PTD.ANFATminiDBD
FUSIoN PRoTEINS IN VITRo
摘要
活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activiated T cell,NFAT)是T
细胞的关键转录因子之一,当T细胞受抗原刺激时,NFAT去磷酸化而发
生核转位,与T细胞重要的细胞因子_IL.2肩动子区域结合,激活IL.2
的基因发生转录和表达IL.2,从而激发T细胞活化,导致T细胞介导的
免疫应答的发生发展。大量的研究表明lL一2的表达依赖于NFAT的表达。
人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV一1)
基因编码的反式激活蛋白(Trans.activator transcription,TAT)中的蛋白
转导结构域(protein transduction domain,PTD)能够高效、快速地携带
外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞,进入细胞浆,由于其具有核定位信
号,因此也能进入细胞核内,同时PTD具有不影响其携带的目的蛋白功
能的特点。
目的:研究带PTD的NFAT最小DNA结合片段的突变体(PTD
conjugated mutant of NFAT mini DNA binding domain,PTD一△NFAT
miniDBD)融合蛋白对T细胞活化、增殖及其免疫调节功能的影响,为最
终应用于器官移植和自身免疫性疾病治疗研究奠定基础。
江苏大学硕士学位论文
第一篇
PTD.AminiDBD融合蛋白体外功能的研究
THE RESEARCH FoRTHE FUCTIoN oF PTD.ANFATminiDBD
FUSIoN PRoTEINS IN VITRo
摘要
活化T细胞核因子(Nuclear Factor of Activiated T cell,NFAT)是T
细胞的关键转录因子之一,当T细胞受抗原刺激时,NFAT去磷酸化而发
生核转位,与T细胞重要的细胞因子_IL.2肩动子区域结合,激活IL.2
的基因发生转录和表达IL.2,从而激发T细胞活化,导致T细胞介导的
免疫应答的发生发展。大量的研究表明lL一2的表达依赖于NFAT的表达。
人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV一1)
基因编码的反式激活蛋白(Trans.activator transcription,TAT)中的蛋白
转导结构域(protein transduction domain,PTD)能够高效、快速地携带
外源性蛋白穿入几乎所有的真核细胞,进入细胞浆,由于其具有核定位信
号,因此也能进入细胞核内,同时PTD具有不影响其携带的目的蛋白功
能的特点。
目的:研究带PTD的NFAT最小DNA结合片段的突变体(PTD
conjugated mutant of NFAT mini DNA binding domain,PTD一△NFAT
miniDBD)融合蛋白对T细胞活化、增殖及其免疫调节功能的影响,为最
终应用于器官移植和自身免疫性疾病治疗研究奠定基础。
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方法:流式细胞术检测m.ANFAT miniDBD融合蛋白穿越细胞膜进入
人急性白血病T淋巴细胞瘤株Jurkat E6.1T细胞中的能力和量效关系,
Western.blot分析和共聚焦显微镜观察确认融合蛋白穿入细胞并定位于细
胞核。通过淋巴细胞增殖抑制实验初步分析融合蛋白对T细胞活化增殖的
影响。进而采用定量RT—PCR检测融合蛋白对活化T细胞中细胞因子IL.2
基因的转录调控。最后运用IL-2报告基因和ELISA的方法确认该融合蛋白
调节活化T细胞分泌的lL.2的作用。
结果:流式细胞术分析发现PTD.△NR钒miniDBD融合蛋白均能高效
的转入细胞内,且发现融合蛋白在2.56/tM与细胞共育2h时蛋白穿入细
胞效率最高;Western.blot和共聚焦显微镜观察进一步发现融合蛋白能够
进入细胞,并定位于细胞核;同时经细胞增殖抑制实验证实
PTD.ANFIATminiDBD融合蛋白能明显抑制T细胞的活化增殖能力;定
量RT-PCR、IL.2报告基因以及ELISA从转录水平和蛋白水平证实了
FID.△N]FATminiDBD融合蛋白可以显著下调活化T细胞中IL.2的表达。
结论:PTD.△NFATminiDBD融合蛋白能有效地导入细胞,并定位于细
胞核内,并能抑制T细胞的活化,为进一步研究其免疫抑制机制和应用研
究奠定了基础。
关键词:蛋白转导结构域,NFAT,IL-2,免疫抑制
ll
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ABSTRACT
Transcription factor NFAT is one of the important and key transcriptors
of T cells.When the T cells were stimulated by antigen,NFAT would
dephosphorylated and translocated into the nucleus.Binding with the
promotor of IL-2 gene,it underwent to activate the gene transcription,then
followed with the T cells activatied and the immune response.Many
experiments had demostrated that IL-2 activation is dependent on the NFAT
translocation.
The protein transduction domain(Pa D),a short basic peptide fragment of
transactivator(TAT)protein encoded by the human immunodeficiency virus
type 1,has been developed to allow the delivery of exogenous proteins into
almost all living eukaryotic cells rapidly and efficiently.The PTD fusion
proteins can be located not only in cytoplasm but also in nucleus for the
PTD contains a nuclear localization signal(NLS)domain.PTD doesn’t affect
the bioactivities of fusion proteins.
objective:To evaluate the bioactivities and elucidated the mechanisms
of functions of the fusion protein of PTD conjugated mutant of NFAT mini
DNA binding domain(PaD-ANFATminiDBD)on T cells activation,
proliferation and their immune functions,and to settle the foundation of
application of the fusion protein for preventing and treating organ rejection
and autoimmune diseases.
Methods:The transduction efficiency of the fusion proteins were
III
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analyzed by FACS and the location of fusion proteins were detected by laser
scan confocal microscope and evaluated by western—blot locate.The inhibition
of T cell proliferation of the fusion proteins were analyzed by Cell Counting
Kit-8(CCK一8).The expression levels of mRNA of IL-2 in activiated T cells
were detected by RT—PCR.1L-2 reporter gene assay and Enzyme-linked
immunosorbent assay were used to detecte the IL-2 expression levels in
activiated T cells.
Results:FACS assay indicated that fusion proteins could transduce into
Jurkat cells efficiently and the intracellular fusion proteins concentration got to
the peak after the proteins were CO—cultured with cells for 2h at 2.56乒,M.The
laser scan confocal microscope showed that the fusion proteins not only
located in cytoplasm but also in nucleus.It was also confirmed by
western—blot.Cell proliferation assay displayed that PTD-ANFATminiDBD
fusion protein could inhibit the proliferation of T cells.The RT-PCR,ELISA
and IL—·2 reporter gene assay indicated that PTD··ANFATminiDBD fusion
protein could obviously inhibit the amount of IL-2 not only at the
transcriptional level but also the protein level in the activated T cells.
Conclusion:The PTD—ANFATminiDBD fusion protein could
transducet into the T cells and located in the nucleus and inhibited the T cell
activated.
KEY WORDS:PTD,NFAT,IL·2,immune suppression
lV
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第一章绪论
1.1 PTD简介
蛋白转导是指蛋白具有自主跨过细胞膜转运蛋白的功能。蛋白质转导结构域
(Protein transduction domain,PTD)或者称为细胞穿膜肽(Cell penetrating peptides,
CPPs)是新近发现的一种能够携带各种物质进入细胞及细胞核的一种肽l¨。HIV.W汀
中的PTD是最常用的蛋白转导肽之一,是源自人类免疫缺陷病毒Tat蛋白的一段碱
性氨基酸多肽,能够携带蛋白质、DNA、多肽、磁珠和脂质体等以一种浓度依赖的
方式高效快速地导入细胞内,进行细胞间以及细胞内的传输,不受细胞类型影响,
且细胞讵常结构也不会受到损伤。
1.1.1蛋白转导域种类与结构
近年来,多个蛋白质转导结构域陆续被发现,目前常用的高效蛋白质转导结构
域主要包括以下几种。HIV.1的反式激活蛋白吖汀中的PTD片段12l;来源于黑腹果
蝇的触角蛋白基因产物(The Antennapedia protein from Drosophila,ANTP);人单
纯疱疹病毒l型(HSV.1)VP22:MPG结构域,是HIV.1糖蛋白41的一段疏水序列
和SV40大T抗原上亲水性的核定位信号的融合肽。碱性helix—loop-helix(bHLH)
结构域131。此外还有以下几种具有细胞穿膜效应的多肽:V型的DNA区域肽抗原结
合的抗体;卡波希氏的成纤维细胞生长因子Kaposi FGF;生长因子受体结合蛋白2
(Grb2)的SH2域;整合蛋白(Integrin)133;HIV一1糖蛋白gp41(1223);Caiiman croc.
19(V)light chain以及Influenza HA22(1 220)等。
HIV—TAT中的PTD是最常用的蛋白转导肽之一,它由HIV.TAT基囚的第一个
外显子编码的第48.56位氨基酸残基组成,其中包含核定位信号14,51。Green和Frankel
分别证实了胞外的HIV.吖汀能够穿过胞膜进入细胞到达胞核12,剐。随后,Vivesl4】等
进一步研究发现,n盯蛋白中真正具有转导作用的是序列为YGRKKRRQRRR,等
电点为12.7的一段富含碱性氨基酸、带J下电荷的多肽,称之为PTD(氨基酸47.57)。
HIV.TAT蛋白在结构上可分为5个功能区17,81。酸性N术端区(1.21),与TAT激
活HIV.1基因表达有关;富含半胱氨酸区(22.37),含有7个Cys,其中6个Cys
是维持TAT蛋白活性所必须的,有研究表明富含Cys的功能区可能参与反式激活应
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答(Transactivating Response,TAR)RNA序列的结创9】;中心区(38.47),含RKGLGI
基序;基础区(48.57),由一组带正电的碱性氨基酸残基构成,高度保守。位于48.52
氨基酸GRKKR作为核与核仁定位的保证,可介导自身或异种蛋白进入细胞核;C
末端区(73.101)含RGD基序可使TAT与细胞整合素结合。
1.1.2蛋白转导域介导蛋白跨膜的机制
有关蛋白转导域确切的内在穿膜机至今尚未明确,现己知此机制中不存在受体、
载体、以及细胞吞噬现象110l。虽然细胞对不同的蛋白转导结构域摄入量相似,但是
研究表明细胞转运速度与碱性氨基酸尤其是与精氨酸残基量密切相关,这表明蛋白
转导域的作用机制依赖于其碱性电荷与细胞表面的相反电荷之间的作用111’121。对于
TAT.m而言,TAT蛋一转导域要先接近细胞膜,7J‘能与之结合【13,14l。目前认为,
吖汀蛋白转导域的具体结合过程大致分为以下两种:①多位点结合模式115l;②静电
吸引模式,也称化学分隔11州。已知.1YI'D的基础区是由带有强的正电荷的碱性基酸构
成,推测其可能是通过与带负电荷的细胞膜脂类直接相互作用而介导蛋白穿膜入细
胞,有研究表明精氨酸中的N原予被0原子取代得到的胍氨酸均聚物没有转导能力,
在胍基与多肽链之间接上烷基间隔基对细胞摄入量无明显影响,由此可见胍基对于
转导是一个关键的结构因素111’17l;此外PTD也可能是通过类似于某些病毒进入细胞
的方式,与胞膜表面的乙酰肝素硫酸脂蛋白聚糖(Heparan Sulfate Proteoglycan,
HSPG)结合,从而介导细胞内摄作用,将蛋白摄入细胞内[18-20】,Tyagi等人发现在
TAT融合蛋白参与的转导过程中,一些在生物合成磺化的硫酸肝素蛋白聚糖过程中
受损伤的细胞可选择性的被破坏,这一结果进一步从反面证实了人们的推测1211。
PTD的上述穿膜机制,使得其可以导入近乎所有细胞,包括破骨细胞,外周单个核
细胞及原代细胞等一些常规方法难以转染的细胞,甚至还可以透过血脑屏吲22。。
1.1.3 HIV n”PTD转导优越性
蛋白转导作为一种强有力的转导方法,可以直接将蛋白转入哺乳动物细胞中甚
至其体徙j[20,22-26】。尽管蛋白转导的方法有很多,但是目前应用最为广泛的足利用PTD
和所需蛋白相连接,构建具有高效转导进入哺乳动物胞内的融合蛋白。研究表明利
用该种方法,多种转录因子127】和酶类128,29】融合蛋白已经成功转运至胞内。近来应用
HIV TAT PTD转导技术可以将药物、化合物、肽段、寡核苷酸、大分子蛋白(如抗
体、酶、分离的蛋白质)、金属离子、甚至200nm的脂质体均可导入细胞内l24‘30l。
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操作很简便,只需将融合的分子直接加入到组织培养基中,15分钟胞内即可达到最
大浓度,并且每个细胞内的蛋白浓度近乎相刚31,翊。这样,既可控制细胞内的蛋白
浓度,又可控制作用时间,一般20-200/.tM终浓度即可发挥生物学效J立1331。
1.1.4 HIVTAT PTD的应用
PTD序列高效的转导作用,使得越来越多的研究者利用PTD携带外源性蛋白或
者多肽等物质进入细胞内发挥生物学作用。1999年,Schwarze等122l首次在体内证实
了仉盯蛋白转导域的蛋白转导作用。Guegan等134l发现,静脉注射仉盯.XIAP(凋
亡抑制蛋白)能够进入大脑皮层细胞,并能够有效地抑制caspase的活性,显著地降
低了梗死的体积。Chen X135l等发现,PTD—HbcAg融合蛋白不仅能够高效诱导小鼠体
内抗体产生水平,并且能够明显上调IFN.Y、IL-2、lL广4以及IL-10等细胞因子的水
平。除了可以用于转导外源性蛋白,PTD还可用于连接纳米粒,携带其进入细胞内
【矧,且转导效率与纳米粒的分子结构相关。此外,除蛋白转导功能外,带有PTD核
心序列的融合蛋白还可以促进大肠杆菌中异种蛋白的表达【371。这些研究表明PTD不
光具有广谱的蛋白转导作用,还有许多未知的功能等待我们去探索发现。
1.2 NFAT简介
细胞活化是转录因子调控相关基因表达作用的结果。研究表明包括T细胞活化
因子(Nuclear Factor ofActivated T,N即汀)家族在内的多种转录因子,在调控基因
表达、细胞活化及分化过程中发挥着蘑要作用。对于NFAT蛋白家族的研究多集中
于其对免疫细胞活化和调节的作用,比如说对细胞因子的调节l381。此外,多数证据
表明NFAT转录因子不仅广泛存在于免疫系统中,也广泛分布于其他多种细胞及组
织中,并且通过调控相关基因转录来控制细胞周期、细胞发育、细胞分化、血管的
生成以及潜在的肿瘤发生139小】。
1.2.1 NFAT蛋白家族
NFAT首次被发现是作为一种与人IL-2启动子的术梢ARRE2结合的能快速诱
导的核因子。以往的研究证实了NFAT蛋白可以调节多种不同基因的表达,包括
信号肽、细胞凶子、细胞表面受体、细胞周期以及凋亡相关蛋白。转录因子NFAT
家族编码四种钙离子信号依赖的不同的蛋白,NFATl (NFATp/NFATc2)、
NFAT2(Nf’ATc/Nf、ATc 1)、NFAT3(NFATc4)、NFAT4(NFATx/NFATc3),
另一个家庭成员NFAT5(TonEBP)是由渗透压所调控的138,451。NFATl作为首个被
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发现的家族成员,是从鼠类和人Jurkat细胞cDNA中克隆而来f46—71。NFAT2同样
也是克隆I圭lJurkat细刺481。NHFAT3和NFAT4分离I;1Jurkat、人外周单核细胞以及
人胸腺细胞的cDNA。
虽然被命名为T细胞活化因子,但是NFAT不仅表达于T细胞中,同样也表达
于其它免疫细胞及非免疫细胞中。NFATl、NFAT2以及NFAT4均以蛋白形式表
达于外周T细胞及B细胞中,此外,蛋白形式的NFATl还表达予肥大细胞、NK细
胞以及某些特定的单核和巨噬细胞中【38,451。NFATl NFA佗以mRNA形式表达于
外周淋巴组织中,并且NFAT2的mRNA表达水平在活化的T细胞和NK细胞中是上
调的148,49l。NFAT4以mRNA形式在胸腺中高表达在外周淋巴组织中低表达149,删。
然而,多项数据也证明NFAT蛋白同样也存在于各种非免疫细胞系及组织中,例
如神经元细胞系及神经系统组织中、内皮细胞系、骨骼、心肌、软骨细胞、角蛋
白细胞及脂细胞等138,42’5¨。
NFAT家族成员的所有亚型中都包含了两个区域,分别为DNA结合区以及
NFAT同源区147,52l。DNA结合区是一段高度保守的区域位于400.700氨基酸之间,
并且和REL蛋白家族具有相似的序列【521。这段区域是转录因子与AP.1的DNA结
合反式激活区,通过结合,发挥其与AP.1的相互作用【38,45】。NFAT同源区位于N
术端,i=[t300个氨基酸组成,其中包含了NFAT家族中几个高度保守的基序147’49,
50】
o
1.2.2 NFAT对细胞的活化机制
钙调蛋白磷酸酶(Calcineurin CaN)是活化NFAT发挥作用的主要激活因子
1531,CaN属于丝氨酸苏氨酸蛋白磷酸酶家族,广泛分布于全身组织细胞中,调节
多种细胞功能,是至今发现的唯一受Ca2+和钙调蛋白调节的丝氨酸苏氨酸蛋白磷
酸酶。NFAT转录因子在胞内钙离子浓度较低的时候以一种高度磷酸化的状态存
在于胞浆中,但是当钙离子水平升高时,即快速脱核磷酸化。CaN介导的NFAT
脱磷酸化使得NFAT的入核序列暴露出来从而使得其转运至核内。反之,在一系
列蛋白激酶例如糖原合酶的作用下,NFAT的出核序列被暴露出来并且重新磷酸
化返回胞浆。提高CaN的活性可以维持NFAT在核内的定位,一旦入核,NFAT
便同特异性的DNA元件相结合并协同其它转录因子(AP.1、MEFs及NFr.B)共
同发挥作用。由此可见,NFAT的活化过程可以分为多个步骤:胞内钙动员,NFAT
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的去磷酸化,NFAT核转位,与靶DNA结合,与其他核蛋白协同作用。控制该活
化过程的任一步骤均可抑制NFAT活化,从而抑制T细胞活化效应。
1.2.3 NFAT在免疫系统中的功能
成熟的T细胞主要表达NFATl和NFAT2,缺乏这两种蛋白的细胞在受到抗原刺
激后则无法产生某些细胞因子,这表明NFAT在活化的淋巴细胞中对多数细胞因子的
基因转录起着重要作用。研究发现,在正常小鼠中,NFATl的活化可以诱导某些细胞
内抑制因子或细胞表面受体表达,或降低效应蛋白表达,从而减弱免疫反应强度,并
可能限制Th2型细胞因子的后期表达154l;而NFAT缺陷小鼠、NFATl和NFAT2双敲
除小鼠和NFATl和NFAT4双敲除小鼠的免疫表型都证明了NFAT在T细胞发育和
活化过程中发挥重要作用155.571。
此外,作为T细胞活化因子,NFAT最重要的功能就是选择性诱导细胞因子及其
它免疫调控基因的转录,这些可被NFAT诱导的靶基因包括:(至)IL-1B、IL-2、IL.3、
lL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-IO、IL-13、GM.CSF、1FN-1,、TGF.13和TNF.a等细胞因
子;(g)C040L、CD25、CD69、CTLA.4和Fasl等表面受体;③NFlcBl、c—Rel、Oct一2
和Nur77等转录因子。NFAT通过调控这些基因来影响免疫细胞的生成、活化、分化、
存活和死亡138,47,5引。
1.2.4免疫扛p制剂
目前临床使用的免疫抑制剂主要包括以下几大类:细胞因子抑制剂:环孢素
A(CsA)、他克莫司(FK506)、雷帕霉素等;DNA合成抑制剂:霉酚酸酯(MMF)、
硫哗嘌呤(AZA)等;激素类:泼尼松、甲基泼尼松等;抗淋巴细胞抗体:抗淋
巴细胞球蛋白(ALG)、抗胸腺球蛋白(ATG)等;植物药类:雷公藤多苷、白
芍总苷、冬虫夏草等。其中CsA和F飚06是免疫抑制治疗中的主要药物,为器官
移植迎来了革命性时俐591,很多研究比较-]"CsA矛[IFK506160石31,总体的研究表明:
对于肝移植后的免疫抑制水平,FK506Id',CsA更有优势160,6¨。CsA和FK506都是通
过!亏CaN形成三聚体复合物,作为底物阻断Ca2+.CaN信号通路,最终抑制了NFAT
的活化及下游靶基因的表达。同时这些药物的毒性也随其抑制免疫系统外细胞内
CaN的能力而增加,产生了很多副反应(如肾毒性、神经毒性、高血压、糖尿病、
胃肠道紊乱等)145】。lltPbHojo等发现CsA能通过诱-导TGF.B的产生来诱发癌症【矧。
这些临床副反应阻碍了它们在许多免疫抑制治疗疾病中的应用。随着对免疫抑制
剂研究的不断深入,制药界研制出了不少具有临床应用价值的新型免疫抑制剂。
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例如达昔单抗(赛尼哌)、来氟米特(爱若华)等。还有许多新剂型也不断问世,如
国内外应用制剂新技术将CsA$1J成微乳口服剂、纳米粒、脂质体制剂及栓剂、滴
眼剂等。由于CsA、FKS06、AZA和MMF等免疫抑制剂在临床应用中还存在不同
程度的毒副作用,因而继续开发高效、低毒和有抗慢性排斥作用的化学和生物药
物,仍然是科学家们不懈追求的目标。
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第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义
2.1研究目的
研究目的:研究PTD.△NFATminiDBD融合蛋白的生物学作用。
将△NFATminiDBD、PTD.eGFP、PTD.△NFAl’miniDBD融合蛋白与人外周血
单个核细胞(human peripheral mononuclear cells,PBMC)共育,研究观察其活化的
PBMC细胞增殖的影响,为深入研究其在自身免疫性疾病和移植排斥反应治疗中的
作用奠定实验基础。
2.2研究方法和技术
蛋白纯化技术、蛋白质印迹技术、流式细胞术、激光共聚焦显微技术、实时定量
PCR技术、ELISA技术、报告基因转染技术。
2.3实验方案的设计
体外实验证明融合蛋白的生物学功能
2.4研究意义
随着外科技术的进步、器官保存方法的改进、高速交通的发达、移植
中心的建立,特别是新的副作用少、效力强大的免疫抑制剂如CsA、FK.506
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和单克隆抗体OKT3的应用,器官移植的疗效大为提高,然而这类药物伴
随的严重副反应使得其临床的应用受到限制。随着对NFAT信号通路研究的深
入,人们发现核转录因子激活蛋白.1 (activator protein一1,AP。1)是NFAT的
一个重要的协同转录因子,当T细胞接受TCR和CD28双重信号刺激后,NFAT
能够与AP.1形成转录复合物结合相关基因启动子区域的特异序列,诱导依赖
NFAT的相关基因转录。IL-2是T细胞活化的一个重要的细胞因子,lL.2启动
子非常依赖NFAT与AP.1的协同作用。在IL-2启动子上游有3个NFAT:AP.1
结合位点,从而实现IL-2基因的高效转录,促进T细胞活化,启动免疫应答。
通过对NFAT/AP.1/DNA三元复合物的突变研究表明l吲,人NFAT蛋白上第466
位精氨酸突变为丙氨酸(R466A)和第533位苏氨酸突变为甘氨酸(T533G)
后,这种NFAT与靶DNA的亲和力不变,但不能结合AP一1。由此,我们设想
构建NFATminiDBD(R466A厂r533G)突变体(即△NFATminiDBD),与内源
性NFAT竞争结合靶DNA,但是,转录因子不同于细胞因子及生长因子,它
必须进入细胞核内才能发挥转录调节作用,因此我们利用具有核转导作用的蛋
白结构转导域PTD,与NFATminiDBD蕈组构建PTD.NFATminiDBD这样一个
具有穿膜效应的融合蛋白,将其导入到T细胞核内,与T细胞活化后内源性的
NFAT/,AP.1复合物竞争结合启动子上的靶序列,从而达到抑制lL.2转录以及
细胞增殖的只的。该突变体融合蛋白与CsA和FK-506作用的途径类似,但作
用靶点更低、特异性更强,因此这个突变体有可能成为较为理想的NFAT的抑
制荆。
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第帚二三早章头实瓤验俐材不料冲
3.1细胞和细胞株
PBMC细胞来自健康供血者、Jurkat E6.1 T细胞株由北京大学医学部T细胞研
究到陈慰峰院士赠送。
3.2实验菌株和质粒
大肠杆菌菌株DH5a为本室保存,pQE30a.△NR气TminiDBD质粒、
pQE30a—PTD-eGFP质粒、pOE30a.PTD-△NFATminiDBD质粒、pQE30a.
PTD.△NFⅣrminiDBD.eGFP质粒、为本室构建并保存。3 (NFAT-APl一
lL2P/Luciferase)表达质粒、pRL-TK表达质粒由北京军事医学科学院基础医学研
究所黎燕和肖鹤研究员赠送。
3.3主要试剂
T4 DNA连接酶、核酸电泳分子量标准DL一2000(TaKaRa公司);质粒小量抽
提试剂盒(Axygen公司);质粒纯化试剂盒(上海捷瑞公司);预染色低分子量蛋
白(Fermentas公司);细胞增殖试剂盒CCK8试剂盒(同本株式会社同仁化学研究
所);纯化树脂Profinity l MAC镍金属螯合填料(美固Bio—Rad公司产品);鼠抗
一6xHis.Tag单克隆抗体(Cell Signaling公司);HRP标记山羊抗小鼠IgG二抗(北
京中杉金桥公司);ECL-plus显色试剂盒(美国GE公司);蛋白分子量标准(Fermentas
公司产品);异丙基.B.D.硫代半乳糖苷(IPTG)(德国Merck公司产品);新生牛
血清(杭州四季青公司);PRMI.1640培养基(Invitrogen公司);ELISA试剂盒
(武汉Boster公司);PMA、PHA和碘化丙啶(PI)(sigma公司);TRIZOL reagent
(Invitrogen公司);PCR MIX、pMDl8-T vector试剂盒和PCR试剂盒(Takara公
司);RT.PCR逆转录试剂盒(TOYOBO公司);PCR引物(上海生工生物工程技
术有限公司合成);CsA(Novartis公司产品);Dual-Luciferase Reporter Assay System
(Promega公司)。其余常用的各种盐、酸、碱等化学试剂均为进El或国产分析纯。
3.4其他试剂及材料
9
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酵母提取物、胰蛋白胨(OXOID公司),琼脂粉、琼脂糖(上海生工),无水
乙醇、异丙醇、氯仿、甲醛等均为分析纯;细胞培养瓶为Nunclon公司。
3.5主要溶液
LB培养基:胰蛋白胨109,酵母提取物59,NaCl 109溶解于1000mL ddH20中,
高压备用。
LB平板:胰蛋白胨109,酵母提取物59,NaCl 109,琼脂粉159溶解于1000mL
ddH20中,高压后浇板备用。
50xTAE缓冲液(1L):"Iris碱2429,冰醋酸57.1mL,0.5mMEDTA(pH8.0)
100mL,定容至1L。
MgCl2溶液(O.1M):1M MgCl2 12mL、1M Tris.HCI(pH-7.5)1.2mL用去离
子水定容至120mL,高压灭菌。
CaCi2溶液(0.1M):1M CaCl2 15mL、1M Tris.HCl(pH-7.5)1.5mL用去离
子水定容至150mL,高压灭菌。
CaClJ甘油溶液:CaCl2溶液(O.1M)42.5mL、甘油7.5mL混匀,高压灭菌。
结合缓冲液:50mM NaH2P04.2H20、300 mM NaCl、5 mM咪唑、2M尿素,
调整pH至8.0,备用。
洗涤缓冲液:50mM NaH2P04.2H20、300 mM NaCl、100 mM咪唑、1M尿素,
调整pH至8.O,备用。
洗脱缓冲液:50mM NaH2P04.2H20、300 mM NaCl、300 mM咪唑、调整pH
至8.0,备用。
5×Tris.Giycine buffer..Tris 159、Glycine 949、SDS 5.09用去离子水定容至1L。
10%SDS:1009 SDS去离子水定容至1L,调整pH为7.2。
10%过硫酸铵:19过硫酸铵溶解于10mLddH20中,-20。C保存。
30%丙烯酰胺:丙烯酰胺299、N,N’一亚甲双丙烯酰胺19去离子水定容至
100mL,调整pH为7.2。
2xSDS-PAGE loading Buffer:100mMTris.Hcl(pH6.8)、200mM二硫苏糖醇
(DTT),4%SDS,0.2%溴酚兰,20%甘油。
考马斯亮蓝R.250溶液:90mL甲醇:水(1:1,V/V)和10mL冰醋酸混合液,
加入考马斯亮蓝R.250 0.259,充分溶解过滤,备用。
lO
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考马斯亮蓝脱色液:30%甲醇,10%乙酸。
膜转移缓冲液:Glycine 2.9 g、"Iris 5.8 g、SDS 0.37 g、甲醇200mL,去离子水
定容至1L。
10xTBS:809 NaCI,29 KCI和309 Tris溶解于1000mL dd H20中,浓盐酸调
节pH至7.4。
TBS/T Buffer:将10xTBS稀释10倍后以1/1000的比例加入吐温20即可。
Buffer A:10mM HEPES PH 7.9,10mM KCl,1.5 mM MgCl2.1mM DTT。
Buffer B:20mM K-HEPES PH 7.9,420mM NaCl,1.5mM MgCl2.0.2mM EDTA,
0.1mM EGTA,25%glycerol。
3.6主要仪器
二氧化碳培养箱(Forma公司);PCR仪(Eppendoff Mastercycler Personal);
梯度PCR仪(Eppendoff Mastercycler Gradient);高速冷冻离心机(eppendorfcentrifuge
5810R;eppendorfcentrifuge 5417R);流式细胞仪(FACS Calibur System)以及CellQuest
软件;聚丙烯酰胺凝胶电泳仪、蛋白电泳转移装置(Bio.Rad);超低温冰箱(Thermo
electron corporation);C02孵箱(Forma Scientific C02 Water Jacketed Incubrtor);
凝胶成像及分析系统(Gene corporation);空气浴摇床(Edmund Buhler);恒温水浴
箱(金坛金怡公司);精确恒温金属浴(杭州博n科技有限公司);紫外可见光扫描
酶标仪(BIO.TEK公司);C1Si全光谱共聚焦显微镜(日本Nikon公司);XL2020
型超声波破碎仪(美国Misonix公司);Bio.Rad Gene Pulser II电转仪(Hercules,CA,
USA);Lumat LB9507(BERTHOLD);Mx3000P定量仪。
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第四章实验方法
4.1融合蛋白的表达纯化
将测序正确的△NⅣ汀miniDBD、PTD.eGFP、PTD.ANFATminiDBD、
PTD.△NFATminiDBD.eGFP融合质粒转化进入M15表达菌,筛选出阳性克隆并接种于
含Amp芹11Kana的LB培养液中37。C振摇过夜,次R按体积比为1:100接种于新鲜LB培养
液中继续培养至OD600为0.6,--.0.8,加入IPTG至终浓度为lmM,30℃振摇培养4h后离
心收菌,以含2M尿素的结合缓冲液与菌体湿重之比为10mL:19加入结合缓冲液,冰浴
中超声裂解,离心收集上清,加入含有lmL Profinity IMAC金属螫合填料的平衡柱,
用含有100mMI眯唑的洗涤缓冲液洗涤,待流出液OD280趋近于0时,加含有250mM咪
唑沈脱缓冲液洗脱,收集目的蛋白,过滤除菌后置.80℃保存备用。
4.2融合蛋白穿膜功能实验
4.2.1细胞培养及穿膜效应的流式细胞仪检测
Jurkat E6.1 T细胞,常规培养于含10%小牛血清、100u/mL青霉素、1009/L链霉
素的RPMI.1640培养液中。以2x105/:fL细胞浓度种于24孔板,与不同浓度的融合蛋
白共育2h。1000xg离心10min分别收集各孔细胞用PBS洗3次,FASCaliber流式
细胞仪收集以及CellQuest软件分析。试验分组如下:①空白组;②2.5印M
△NFATminiDBD蛋白处理组;③1.2即M、2.5即M PTD.△NFATminiDBD.eGFP蛋白
处理组。
4.2.2激光共聚焦显微镜观测穿膜蛋白在细胞内的定位
1.5mL EP管收集与2.5缸M PTD.△NFATminiDBD.eGFP融合蛋白共育的Jurkat
细胞(2x105个/管),1000xg离心10min。预冷PBS洗2遍,1000xg离心,5min。
加入0.5mL 4%多聚甲醛固定液,缓缓悬起细胞,固定30分钟。离心去固定液,用PBS
洗2遍,沈涤期间手动晃动。加入Pl染色液(终浓度50ug/mL)缓缓悬起细胞,4℃
避光染色30分钟,PBS洗涤。加25/比L PBS重悬细胞并滴加至载玻片上,盖上洁净的
盖玻片,指甲油封片。共聚焦显微镜下使用绿色滤光片检测呈红色荧光的细胞核,使
用蓝色滤光片检测融合蛋白中eGFP绿色荧光。
12
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4.2.3胞浆和胞核蛋白提取及免疫印迹检测
1000xg离心10min收集与1.2即M、2.5舡M PTD·△NFATminiDBD蛋白共育的
Jurkat细胞,用4℃预冷的PBS洗3遍,加400pL预冷Buffer A(10raM HEPEs、10raM
KCI、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA、0.5mM PMSF,pH7.9),冰浴10min;加25雎L
10%NP-40,Vortex 10s,冰浴10min,12000xg离心15s,收集上清,即为胞浆蛋白;
加50pL冷Buffer B(20mM HEPEs、0.4M NaCl、lmM EDTA、lmM EGTA、lmM
PMSF、lmM DTT,pH7.9)至沉淀,置冰上30min;12000xg离心10min,收集上
清,即为胞核蛋白;加等量的2xSDS上样缓冲液,煮沸5min,.80℃冻存备用。提
取的胞浆胞核蛋白用12%SDS.PAGE胶分离;350mA 2h将蛋白转印至PVDF膜;
用5%脱脂牛奶(溶解于TBS/T液)封闭lh;加抗6xHis.Tag(1:1000),4"C过夜,
用TBS/T沈涤3次;加HRP.羊抗小鼠IgG(1:5000),室温lh,TBS/T洗涤3次;
加ECL-Plus化学发光剂,作用5min,扫膜,拍照。
4.3乳酸脱氢酶法(LDH)测定融合蛋白细胞毒性实验
4.3.1分离外周血PBMC
(1)从肘静脉无菌采集正常人外周肝素抗凝血10mL,用等量的PBS稀释。
(2)将稀释血液按1:1比例小心缓慢加在淋巴细胞分离液上,室温2000rpm离心
20min,缓升缓降。
(3)离心后分四层,上层为血浆、血液稀释液和大部分血小板,下层为红细胞和粒
细胞,中间层是淋巴细胞分离液,分离液和血浆交界部位的乳白色混浊液体就是单个
核细胞层;小心吸取该层。用PBS充分洗涤,室温2000rpm离一I二,10min,弃上清;重复
洗涤两次,弃上清。用含lO%d"牛血清的RPMI 1640完全培养液悬浮细胞,吸取1蛳L
细胞悬液,作适量稀释后,用4%的台盼兰染色计算细胞活率。用改良的牛鲍氏细胞
计数板计数。
4.3.2 LDH法检测
用含10%tJx牛血清、lOOU/mL青霉素、1009/L链霉素的RPMI.1640培养液调整细
胞浓度2x106个/mL,每孔1m讲于24孑'L板。先将融合蛋白及CsA处理组与细胞共培养
2h,然后加入PHA和PMA使得终浓度分别为2.5pg/mLc和50ng/mL。细胞置于37。C,5%
C02培养箱中培养,1.5mL EP管收集与蛋白共育24h的PBMC细胞培养上清液200pL,
用全自动生化分析仪,测定LDH的活性单位(U/L).
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试验分组如下:①空白对照组;②5.1劾M△NFATminiDBD蛋白处理组;
③5.1弘M PTD.eGFP蛋白处理组;④2.5单M、5.1犁M PTD-△NFATminiDBD蛋白处理
组;⑤和M CsA处理组;⑥1%Triton处理组;每组做3个复孔。
4.4细胞增殖抑制实验
4.4.1分离外周血PBMC
步骤同4.3.1
4.4.2 CCK8法检测
调整细胞浓度2×106,每孔10毗L种于96孔板。先将融合蛋白及CsA处理组与细胞
共培养2h,然后加入然后力11/X.PHA和PMA使得终浓度分别为2.5flg/mL和50ng/mL,每
孔最后的终体秘用培养液补充至20吮L。
试验分组如下:①空白组对照组;②5.1劾M△NFATminiDBD蛋白处理组;
③5.1弘M P1rD.eGFP蛋白处理组;④2.5酗M、5.1犁M P1rD.△NFATminiDBD蛋白
处理组;;⑤跏M CsA处理组;每组做3个复孔。将细胞置于37*(2,5%C02培养
箱中培养24h后加入20肛L/:fL的CCK.8试剂,继续培养4小时,用酶联免疫分析仪,
以450 nm为检测波长和650 nm为参比波长测定各孔吸光度值。
4.5细胞因子IL.2的RT.PCR检测
4.5.1分离外周血PBMC
步骤同4.3.1
4.5.2实验分组
如4.4.2
4.5.3提取总RNA
收集每个样本2x106个细胞,转移至1.5 mL eppendorf管中,离心去上清,轻弹
管底,使细胞分散,加入1 mL TRIZOL轻轻颠倒eppendorf管混匀2—3次,一80。C过
夜;次日,取出eppendorf管,室温静止15 min,待完全溶解后加入氯仿,0.2 mL/
管(匀浆液的1/5体积),盖紧eppendorf管盖子,剧烈震荡溶液15 SeC,使之充分
混匀,室温放置15 min;然后在4。C条件下,转速为12 000 g,离心20 min。离心后,
溶液分为上下两层:上层为无色透明;下层为粉红色;两层之问有一层很薄的白色
物质;转移上层的无色透明的上清液到一个新的1.5 mL的eppendorf管中(每1 mL
的匀浆液约可收获500/.tl的上清液);加入等体积的异丙醇,上下颠倒6.8次,充
14
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分混匀溶液;室温下,静置溶液10 min(为最大量沉淀总RNA,可以在.20*(2条件下,
放置溶液2 h以上);4℃条件下,转速为120009,离心15 min。离心结束后,在
eppendorf管管底可以看到乳白色的总RNA沉淀。吸去上清溶液,加入1 mL 75%乙
醇(DEPC水配制)/管,洗涤沉淀4℃条件下,转速为8000 g,离心10 min;吸去
上清溶液后,再次在4℃条件下,转速为8000 g,离心5 min,以去除残留乙醇溶液;
空气干燥总RNA沉淀5—10 min,加入30∥l DEPC处理过的无菌超纯水充分溶解总
RNA沉淀;紫外分光光度计上测定总RNA的OD260,OD260/OD230值和OD260/OD2印
值,以检测总RNA的纯度、质量与含量。
4.5.4逆转录反应
以1肛g的mRNA逆转录合成cDNA第一链。
逆转录PCR反应体系:录PCR反应体系:
Components Volume m1)
5xreaction buf佗r
dNTP Mix(10mM each)
Oligo(dT)
RNase inhibitor
Rever Tra Ace逆转录酶
mRNA
DEPC H20
4
2
1
1
1
X(1∥曲
11.X
Total volume
充分混匀,去除气泡,通过简单离心使其全部集中于PCR管的管底。在PCR扩增
仪上逆转录,循环条件依次为:42℃,20min;94℃,5 min(将逆转录酶灭活);4℃,
5 min。
4.5.5梯度PCR扩增:
在O.2 mL PCR管中建立10/【lLPCR反应体系,加入的各成分分别为:
15
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反应体系为:
Components Volume(肛L)
10×PCR reaction bufffer
dNTP Mix(10 mM each)
Sense Primer(IO/llM)
Antisense Primer(IO/比M)
eDNA
rTaq DNAPolymerase(40 U)
No nucleic acid sterile H20
1.0
0.8
0.2
0.2
O.5
O.1
7.2
Total Volume 10.O
混匀后94*(2预变性2分钟,进行梯度PCR扩增。
各基因扩增所用引物和PCR反应所选择的温度为:
A.B—actin Forward primer:CACGAAACTACCTTCAACTCC;
Reverse primer:CATACTCCTGCIq'GCTGATC;
B.IL-2 Forward primer:CAAAGAAAACACAGCTAC AACT;
Reverse primer:TCTCATCAGCATATTCACACAT;
C.所选温度为:54.2℃,55.2*0,56.4"C,57.5℃,58.5℃,59.4"0
4.5.6标准质粒的构建
DH5a感受态细胞的制备
.70。C取出DH5a细胞,在LB琼脂板上用三区划线法划板,37"C培养过夜。挑取最
大的单个菌落,接种于LB液中,37。C,250 rpm摇菌过夜。取出2 mL过夜菌液接种于
200 mL LB液中,37。C,250 rpm振摇至细菌培养液OD600=0.5。收集菌液置于冰上冷
却后,4℃,5000 rpm离一t二,10 min。弃上清,用预冷I均MgCl2溶液重悬。冰浴5 min后,
4。C,5000 rpm离一I二,10 min。弃上清,用预冷的CaCl2溶液重悬。冰浴20 mind,4*0,
4000 rpm离一5q0 min。弃上清,重悬于10 mL CaCl2甘油溶液,100/zl/1.5mL eppendorf
管分装,.70℃保存。
T.A克隆
使用T.A克隆试剂盒,将纯化后I筝JPCR产物基因片段连接/入,pMDl8.T载体.
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连接反应体系:
Ec嘏V一--T-Cloning Site
Components Volume mL)
pMDl 8-T vector
Insert DNA
Solution l
1.0
4.O
5.O
16℃连接30 min。把全量(10∥1)转化入100肛l DH5a感受态菌中,冰上放置30 min。
42*(2热激90 sec,再在冰上放置1 min。加入890∥l LB培养皋,37*(2, 150 rpm振荡培
养1 h。3000 rpm离,1",,5min,弃去部分上清,混匀,涂布在含有100∥∥mL Amp的LB一
琼脂平板培养基上,培养12—16 h。
质粒的提取及鉴定
挑选单个菌落,接种子LB培养液中。37*(2,250 rpm摇菌过夜后提取质粒。
质粒提取步骤(采用Axygen质粒小量抽提试剂盒提取质粒):
收集过夜培养的菌液4 mL,4℃12000 rpm离心lmin。尽量弃尽上清。加入250∥l
细胞重悬液,充分重悬细菌。加入250∥l细菌裂解液,轻柔地、充分地上下翻转4.5
次,使细菌充分裂解,直至溶液呈透亮粘稠状,裂解时间不超过5 min。加入350/al
中和液,轻柔地、充分地上下翻转6.8次,使溶液充分混匀,形成白色絮状地沉淀
后,4 0C 12000 rpm离心10 min,使白色絮状物沉淀充分。将一个Miniprep column
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置于2 mL废液收集管中,将上一步离心所得的上清加入Miniprep column中,4"C
12000 rpm离心1 min,弃去滤液。将Miniprep column置于一个新的1.5 mL eppendorf
管中,加入50∥l无核酸无菌超纯水,12000 rpm离心1 min,收集滤液。吸取3Icll
进行1%琼脂糖电泳鉴定。最后,PCR鉴定阳性质粒。
定量PCR标准曲线绘制
用Eppendof Biophotometer测定质粒浓度,按照下面公式计算质粒拷贝数(C为
质粒浓度,M为基因片段长度),稀释为109.103梯度浓度,测定并绘制标准曲线。
质粒拷烈数(copies/p1):
C×10。9
x6.02x 10黔
4.5.7细胞因子IL-2的RT-PCR
将分离得到的PBMC用RPMI.1640培养液调整到浓度为2x106/mL,按每孔1m脚
到24孔板中。用PHA/PMA(2.5pg/mL/50ng/mL)活化细胞Oh,3h,6h,9h,12h,收
集细胞,洗涤,提总RNA逆转录成cDNA,RT-PCR得出IL-2的活化趋势。我们选择IL-2
活化9h。按如下设置分组:①空白组对照组;②5.1私M△NFATminiDBD蛋白处理组;
③5.1犁M PTD.eGFP蛋白处理组;④2.5舡M、5.1劲M PTD.△NFATminiDBD蛋白处
理组;⑤靴M CsA处理组,在加入蛋02h之后,加入P蝴MA(2.5pg/mL/50ng/mL)
活化,收集9h的细胞。洗涤,提总RNA逆转录成cDNA,进行RT.PCR。
以前面逆转录好的cDNA为模板,2xSYBRGreen QPCR Master MIX,在置于冰上
的O.2 mL PCR管中依次加入下列成分:
采用Mx3000P定量分析仪进行mRNA定量分析,PCR反应体系如下:
Components Volume(肛L)
2xMJX
ROX(1:500)
Forward primer(10,uM)
Reverse primer(10 pM)
cDNA
ddH20
7.5pL
0.鳓L
0.2儿L
0.2∥L
1.O“L
5.鼬L
Total Volume 15∥L
】8
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混匀,瞬时离心5秒,使各反应成分集中于PCR管底。反应条件如下:
95"C lOmin,95*(2 30sec,56"C30sec,72*(2 lmin(acquire fluorescence),35
循环
4.6细胞因子IL.2的ELISA检测
4.6.1分离外周血PBMC
步骤同4.3.1
4.6.2实验分组
如4.4.2
4.6.3 EIISA操作步骤
(1)从已平衡至室温的密封袋中取出所需板条,其它板条请封闭放回4"C。
(2)除空白孔外,分别将标本或不同浓度标准品(100#IJ孑L)加入相应孔中,用封
板胶条封住反应孔,37*(2孵育90分钟。
(3)洗板4次。
(4)除空白孔外,加入生物素化抗体工作液(100#L/孑L)。用用封板胶条封住反应
孔,37*(2孵育60分钟。
(5)洗板4次。
(6)除空白孑L外,加入酶结合物工作液(100,uL/;YL)。用封板胶条封住反应孔,37*(2
孵育30分钟。
(7)洗板4次。
(8)加入显色液(100#L/孑L),避光37*C孵箱孵育13.17分钟。
(9)加入终止液(100,u1.J孑L),混匀后即刻测量OD450值(5分钟内)。
4.7 lL.2报告基因的萤光检测
4.7.1实验分组
如4.4.2
4.7.2 Jurkat细胞的电转染
培养Jurkat细胞至对数生长期,用新鲜1640培养基清洗细胞2次,加新鲜培养
基继续培养3h。收集细胞(1~2)x107用转染缓冲液,新鲜1640培养基含(20mM
HEPES)清沈2遍。1000rpm离心5min后,重悬细胞于25毗L转染缓冲液中。同时,
取包含NFAT—APl-IL2P/Luciferase报告基因1陬g表达质粒以及10ng renilla luciferase
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reporter pRL-TK溶于50aL转染缓冲液。将细胞以及报告基因稀释液混匀后(300/tL)
加入4mm转染小杯中,电压280V,电容调至97靴F。转染后细胞重悬于lOmL新
鲜培养基,37℃、5%C02孵箱继续培养18h。将细胞均分于24孔板中,每孔5x105
细胞。分别加相应的融合蛋白及CSA孵育2h后,用PHA+PMA(2.5/l£g/mL+50ng/mL)
作用12h后,收集细胞。
4.7.3报告基因检测
将4倍体积水加入1体积5×裂解缓冲液。使用前在室温平衡1×缓冲液;用PBS
漂洗细胞,此过程必须仔细,尽可能多地将漂洗用PBS吸出;加入足够的1×裂解缓
冲液以覆盖细胞,冻融一次以保证完全裂解;取出,将离心管置于冰上;旋涡震荡
离心管5.10秒钟,然后以12,000xg离心15秒钟(室温)或长至2分钟,将上清液
转移至一个新的试管中;用萤光素酶检测液清洗引导萤光光度计进样器至少3次;
将萤光光度计的程序设置为:2秒延迟及10秒萤光素酶活性测量读数。
4.8统计学处理
采用方差分析法比较组问差异,结果以均数±标准差表示,P<O.05为差异有统计
学意义,P<O.01差异有非常显著意义。
江苏大学硕士学位论文
第五章实验结果与讨论
5 1融合蛋白表达和纯化
经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定融合蛋自浓度后,得到ANFATminiDBD浓度
为60咄g,mL、PTD—eGFP浓度为120q皑,m乙、PTD-ANFATminiDBD浓度为
80q“g,mL,PTD-ANFATminiDBD·eGFP浓度为135毗g/mL。其体实验时用含10%
NCSRPMI一1640培养液稀释融合蛋白将其调整至所需浓度。
5.2 lrl'D一△NFATminiDBD—eGFP融合蛋白穿膜流式细胞术分析
为了榆测所表达纯化的融合蛋白是否能够如设想一样可以转导入细胞,选择了
带有eGFP小踪作用的融台蛋白PTD.ANFATminiDBD—eGFP,采用对数生长期的
Jurkat细胞与不『-/浓度的PTD一△NFATmjmDBD-e6FP融合爱白共育2h,收集细胞,
利jj;{流式细胞仪掩删eGFP荧光强度。实骑结果表明:共育2h后,融合蛋白町以穿
^Jurkat细胞巾,并且2.5缸M的PTD一△NFAT miniDBD.eGFP融台蛋白的穿膜效
率可高达60%(图5.1)。
图5l流式细胞仪分析融合蛋白穿膜2h后进八Jutkal细胞的能力
Fig 5 l AnalysisofTATfusion pmleinstransductioninto Jurkat cells afteriwo hours
5 3激光共聚焦显微镜观察结果
州∞

江苏大学硕士学住论t
111 I‘涉及融合蚩r1’I细J】(_l兆育后丌榆测,复性的蛋白小稳定会导敛聚集黏m丁
细胞表皿,造成流式细胞检测的穿膜假目j性结聚。通过擞光j£聚纯艟微镜观察,发
现:与融合蛋h PTD.△NFATminiDBD—eGFP』k宵的Jurkat fill胞,鲐多荧光叠_fJ||分
析ur见融合蚩臼能够穿人细』胞行定位干细胞桉-}1(图5 2)。
GrP PI Merge
]]F
图5.2激光共聚焦星微镜下分析芽膜蛋白细胞内定位
Fig 5.20bseⅣation ofintcmalization ofTATfusion protein by confocalmlcroscopc
Ceils were Iransduccd with PTD·△,NFATmfuiDBD·eGFP fusion protein(green)fue nucteus weTe
staincd with PI(red),and merged fyellow)
5 4融合蛋白免疫印迹实验
为j』} 步确定融夼蛋n是西进入细胞定位r核内,自必要确定
PTD一△NFATm训DBD融合蚩17j进人细胞厉的分如情况。分别将l 28“M、2.56uM
PTD一△NFATminiDBD转导JurkatT细』胞2h,然后收集细胞,并分别提取姗旭袋和胞核
蚩h采J_}{Western.blot牲定。结果嵌叫:PTD一△NFATminiDBD融合崔广]I U以穿过细
胞膜进入也浆_j{=⋯艇功定何j rJflll胞核山(罔5.3)。
、L c r1 \ L、_■—■●,'-
●‘{】Ⅵ l_}) 、1、j1 『v
出5.3融合蛋白Weste rn Blot结果
Fig 5.2 3Thc resullofWestcm Blot analysisforfusion proteins
5.5 LDH实验检测融合蛋白对PBMC细胞毒一l生的影响
找们阿先』_f获褂的外阁血,p个核细胞(PBMC)进行细胞活率¨锋,结果细胞
活半均人J 08%,随UJ分离EI,J,埘PBMC细胞的损伤较少。为了观察融合蛋F1的生
物学功能,找tf J卣九州家j£对外删l⋯t个PBMC细胞∞毒性作州,LDH站粜耻示:
PTD-ANFATminiDBD谢l合生I’⋯刈』。盯j对照正统汁学意义,刘PBMC-卸1胞没冉
uJ艟细J】[!!毒悱fl訇5.4)。
江苏大学硕士学位论文
200
150

■√
一100

Q

50
O ∥◆一
图5.4融合蛋白的毒性实验
Fig 5.4.Toxicity test of fusion proteins.
Lactate Dehydrogenase(LOll)assay.Data from three independent experiments are presented as
mean+SD
5.6检测融合蛋白对PBMC细胞增殖的影晌
通过LDH实验检测,其结果证实了融合蛋白对PBMC细胞没有明显毒性,在
此基础上,我们进一步观察该融合蛋白的生物学功能。首先,运用CCK8检测试剂
盒检测融合蛋白对PHA+PMA活化的PBMC细胞的增殖抑制作用,图中OD值与细
胞的增殖能力成J下比,结果显示:PTD.△NFATminiDBD融合蛋白组对PBMC细胞
增雅的影响与CsA类似,与PTD—GFP、△NFATminiDBD蛋白对照组和空白组相比
抑制明显,且具有统计学意义(宰木P<O.01)(图5.5)。说明所转导的
PTD.△NFATminiDBD融合蛋白具有明显抑制PBMC细胞增殖的能力。
江苏大学硕士学位论文
1.O
O.8
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善0.6
o
ln
3
O.4

o
0.2
O.O ◆∥ 图5.5增殖抑制结果
Fig.5.5 The inhibiled proliferation results..
The inhibited proliferation of PBMC cells by PTD-ANFATminiDBD fusion protein.Data from
three independent experiments are presented as mean_+SD.。+p<0.01 versus contr01.
5.7细胞因子IL.2群JRT.PCR检测
5.7.1标准质粒的构建
CCK8增殖抑制试验初步证实了融合蛋白对活化PBMC细胞的增殖抑制作用,
为了进一步研究其对T细胞增殖抑制的机制,我们选择了与T细胞活化关系最密切
的细胞因子IL-2作为研究对象,研究融合蛋白对活化PBMC中IL-2表达的影响,
首先通过RT.PCR的方法从转录水平上检测lL.2表达水平的变化。选用PBMC细胞
制备的cDNA模板扩增13-actin和lL.2,其梯度PCR结果见(图5.6.1),收集并纯
化PCR产物,进行T-A克隆,送测序鉴定完全J下确(结果未显示)。
24
江苏戈学硕士学位论王
2000b
I¨¨r J11
750bp
钳JlIbp
2<,Obp
I£¨lI,”
M l 2 3 4 5 6 M l 2
图5.6 1 B-actin/IL.2梯度PCR结果
Fig 5.61 The gradientPCR ofB-actin/Ib2
1.6代表不同的温度:54 2℃,55 2℃,56 4"C,57 5℃,58 5℃,59 4℃
5 7 2细胞因子lL-2的RT.PCR检测
PHA/PMA(2.51fg/mL/50ng/mL)活化PBMC细胞卟,3h,6h,9
收集细胞,洗涤,提总RNA逆转求成cDNA,进彳』_RT-PCR。JL-2的】
水¨1她(H 5.6 2)。融合生白△NFATminiDBD、PTD—GFP终浓度均
PTD一△NFATminiDBD终浓度分别为2.5瓤M、5 1知M,CsA的终非度j
绑胞数为2x100,加入篮自』£孵育2h后,加入PHA+PMA(终浓度分姐
50n“mL)活化,收集忤用9h的细胞,沈涤,捉总RNA逆转录成cDNA,j
IL-2曲mRNA的是选水、F见(罔5.6 3)。{J以发现,PTD.△NFArmi]
罹F调沂化T细胞吖'IL.2细胞凼r的表达,井呈定的浓度依赖陀。

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心芩◇ 姆
图5.6·2 RT-PCR检测不同时间处理PBMC细胞表达11_,-2 mRNA结果。Fig
5.6·3 RT-PCR analysis for the cytokine of IL-2 mRNA expression of PHA/PMA PBMC
cells in different time point.
C
_

aL
N

图5.6.3 RT-PCR检测融合蛋白处理PBMC细胞表达IL.2 mRNA结果(书p<0.05,
料p<0.01)
1
Fig 5.6.3 RT—PCR analysis for the cytokine of IL.2 mRNA expression of PHA/PMA
PBMC cells.The ratio of the target gene versus B-actin at the control was set as 1.Data
t-tom three independent experiments are presented as mean__SD,宰P<O.05 versus contr01.
料p<0.01 versus contr01.
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5.8 IL一2报告基因的荧光检测
转染了NFAT:AP.1的DNA结合位点的IL-2报告基因表达质粒的Jurkat细胞加
相应融合蛋白及CsA共育2h后,加入PHA+PMA(终浓度分别为2.靴g/mL+50ng/mL)
活化,再培养16h后用双萤光素酶测试方法检测其萤光强度,结果如图(5.7)所示:
在PTD.△NFATminiDBD融合蛋白作用18h后,IL-2在蛋白水平上的量明显降低。
图5.7检测融合蛋白处理的Jurkat细胞中IL-2报告基因的表达结果。
Fig.5.7 Effect of fusion proteins on IL-2 promoter activity in PHA/PMA Jurkat cells.
Data from three independent experiments age presented as mean+_SD.‘P<O.05 versus contr01.++
p<0.01 VerSUS contr01.
5.9细胞因子IL.2的ELISA检测
净岩》=ol;
∞∞-,.I
aJ—o;一
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RT.PCR实验证实了融合蛋白能够下调活化T细胞中细胞因子IL2在转录水平上
的表达,接下来,我们进一步研究其对IL-2细胞因子蛋白水平的调节作用。在PBMC
细胞分别和蛋白及CsA共育2h后,加入PHA+PMA(终浓度分别为
2.跏g/mL+50ng/mL)活化后,收集作用24h的细胞上清标本用于IL-2细胞因子的
ELISA检测,结果如图(5.7)所示:同mRNA水平相似,在5.1知M
PTD.△NFATminiDBD融合蛋白作用下,IL-2在蛋白水平上的表达量明显降低。
C=、

詈音
1
图5.8ELISA检测融合蛋白处理的PBMC细胞上清中IL-2的表达结果。
Fig 5.8 ELISA analysis for the cytokine of IL-2 expression of PHA/PMA PBMC cells.Data from
three independent experiments are presented as mean_+SD,¨p<0.01 versus contr01.
5.10讨论
该实验选用Jurkat细胞用于融合蛋白的穿膜定位实验,将含有eGFP的融合蛋白
PTD.△NFATminiDBD与Jurkat细胞混合培养,由于涉及融合蛋白与细胞共育后再检
测,复性的蛋白不稳定会导致聚集黏附于细胞表面,造成流式细胞检测的穿膜假阳性
结果。对于该假阳性结果,流式细胞术的散点图无法『F确判断,但共聚焦显微镜下可
直接观察,因此我们联合应用这两种方法来观察融合蛋白的定位情况,结果显示蛋白
能定位于细胞核内,为进一步确定融合蛋白的穿膜定位功能,我们又用Western.blot
对PTD.△NFATminiDBD融合蛋白进行了鉴定,结果发现2h的时候细胞核内已经有大
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量的可检测蛋白。以上实验结果均表明,带有穿膜序列P11D一△NFATminiDBD融合蛋
白可以直接转导Jurkat细胞中顺利入核,有利于转录因子融合蛋白发挥其生物学作用。
对于运用体内的蛋白药物,我们必须首先检测其是否具有细胞毒性。因此,我
们对蛋白作用过的细胞上清进行了LDH的检测,结果表明,我们所选择的蛋白浓度
在其安全范围之内。
我们采用健康来源的外周单个核细胞(PBMC)进行体外实验的研究。随着对
NFAT信号通路研究的深入,人们发现核转录因子激活蛋白一1(activator protein.1,
AP.1)是NFAT的一个重要的协同转录因子,当T细胞接受TCR和CD28双重信号
刺激后,NFAT能够与AP.1形成转录复合物结合相关基因启动子区域的特异序列,
诱导依赖NFAT的相关基因转录。lL.2是T细胞活化的一个重要的细胞因子,IL-2
启动子非常依赖NFAT与AP.1的协同作用。在IL-2启动子上游有3个NFAT:AP.1
结合位点,从而实现IL-2基因的高效转录,促进T细胞活化,启动免疫应答。通过
对NFAT/AP.1/DNA三元复合物的突变研究表明|651,人NFAT蛋白上第466位精氨
酸突变为丙氨酸(R466A)和第533位苏氨酸突变为甘氨酸(T533G)后,这种NFAT
与靶DNA的亲和力不变,但不能结合AP.1。由此,我们将NFATminiDBD
(R466A/T533G)突变体(即△NFATminiDBD)通过PTD先导入到T细胞核内,
与T细胞活化后内源性的NFAT/AP.1复合物竞争结合启动子上的靶序列,从而达到
抑制IL-2转录的目的。免疫应答调节方式主要包括两个方面:依赖免疫细胞表达的
表面分子和分泌的细胞因子进行调‘节166,671。基于以上研究成果,我们对融合蛋白处
理的PBMC细胞分泌的细胞因子IL-2进行了检测, mRNA水平和细胞上清中的蛋
白水平都可以看出,PTD.△NFATminiDBD融合蛋白可以明硅抑制活化T细胞中IL-2
的表达,且呈一定的剂量依赖性。在增殖抑制实验中也可以看到与对照组相比,目
的蛋白能有效的抑制细胞的增殖。并且,我们实验室其他成员在观察目的蛋白对心
脏移植大鼠排斥反应的调节作用研究中发现,目的蛋白可以明显延长心脏移植大鼠
的存活期。因此,可以得出结论,PTD.△NFATminiDBD融合蛋白具有一定免疫抑
制作用。
综上所述,我们的研究结果表明,外源性的△NFATminiDBD蛋白可以与具有穿
膜功能的PTD序列融合表达,通过PTD直接转导Jurkat细胞并保持其生物学活性,
并且PTD.△NFATminiDBD融合蛋白对于活化T细胞的免疫抑制作用也得到了证
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实。因此,我们认为带有穿膜序列的PTD.△NFATminiDBD融合蛋白有可能为自身
免疫性疾病以及移植排斥反应的治疗提供新的途径。
江苏大学硕士学位论文
第六章主要结论及展望
6.1主要结论
本项研究主要通过分子生物学和细胞生物学技术进行了相关的研究,主要结论如下:
1、采用流式细胞术、激光共聚焦技术及Western-blot分析证实了PTD序列可以将
△NFATminiDBD蛋白有效地导入Jurkat细胞中并主要定位于细胞核内。
2、检测培养细胞的上清中LDH的水平证实融合蛋白对细胞没有毒性作用。
3、运用CCK8细胞增殖试验证实了PTD.△NFATminiDBD融合蛋白具有抑制PBMC细
胞增殖的能力。
4、Real time PCR检测蛋白处理的细胞证实了PTD.△NFATminiDBD能下调IL-2在转录
水平上的表达。
5、ELISA、Luciferase assay检测蛋白处理的细胞证实了PTD-△NFATminiDBD能下调
IL-2在蛋白水平上的表达。
6.2展望
本研究关于PTD.△NFATminiDBD融合蛋白的功能,只是一初步工作,接下来,我们
将要进行的工作有:
1.通过CHIP、EMSA技术进一步明确融合蛋白抑制T细胞活化的作用机制;
2.利用eGFP示踪技术体内观察融合蛋白进入体内细胞、组织和器官中的定位与动
力学分布、体内代谢和不良反应等; ·
3.近来有研究表明(Wu et al,cell,2006)FOXP3能够与AP.1竞争结合NFAT从而
发挥其生物学功能,我们可以将此蛋白和组内构建的PTD.FOXP3共同转导CD4+
T细胞,观察转导后T细胞的增殖能力以及是否诱导T细胞耐受;
4.设计针对FOXP3的NFAT突变体蛋白,阻断二者的结合,从而为研究FOXP3
的功能和调控机制提出一个新的思路。
5.近来关于NFAT与肿瘤之问关系的研究受到关注,我们将观察该突变体NFAT
融合蛋白对肿瘤细胞的生长抑制作用。
31
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第二篇
PTD—Foxp3融合蛋白对小鼠T淋巴瘤细胞的增殖及细胞凋亡的
影响
PTD.Foxp3 fusion protein inhibits cell proliferation and
induces cell apoptosis of mouse T lymphoma cell line EL-4
摘要
目的:探讨含有蛋白穿膜结构域(protein transduction domain,PTD)
的小鼠Foxp3(PTD—mFoxp3)融合蛋白对小鼠T淋巴瘤细胞系EL一4的细
胞增殖和诱导凋亡的影响。
方法:采用CCK8细胞增殖试验,Annexin V.FITC和Pl双染流式细胞
术观察分析PTD.Foxp3融合蛋白对EL一4细胞增殖的影响和诱导其凋亡的
作用。
结果:PTD.Foxp3融合蛋白对EL.4细胞具有增殖抑制作用,并呈现剂
量依赖性;PTD.Foxp3融合蛋白还具有诱导EL-4细胞凋亡作用。
结论:小鼠PTD.mFoxp3融合蛋白对小鼠T淋巴瘤细胞(EL-4)具有
增殖抑制和诱导细胞凋亡作用。
关键词Foxp3;小鼠T淋巴瘤细胞;细胞增殖;细胞凋亡
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ABSTRACT
Object:To investigate the effect of PTD—Foxp3 fusion protein on
cell proliferation and cell apoptosis of mouse T lymphoma cell line
EL.4.
Methods:The cell proliferation was detected by Cell Counting
Kit-8(CCK8)and the percentage of apoptotic cells was determined by
Annexin V-FITC and PI double staining and flow cytometry.
Results:Cell proliferation assay shown that PTD—Foxp3 fusion
protein could inhibit the proliferation of EL-4 cells with a dose
dependent manner;Flow cytometry assay results demonstrated that
PTD—Foxp3 fusion protein can induce apoptosis of EL一4 cells.
Conclusion:The PTD—Foxp3 fusion protein inhibits cell
proliferation of EL-4 cells significantly and induce apoptosis in EL一4.
Key words:Foxp3;mouse T lymphoma cell;cell proliferation;apoptosis
33
江苏大学硕士学位论文
第一章绪论
1.1 Foxp3简介
FOXP3是调节性T细胞(regulatory T cells,Treg)发生、发育和发挥生物学功
能必需的关键性转录因子。FOXP3最初被认为是调节性T细胞特异性表达的转录因
子,随着研究的深入,人们发现FOXP3同样表达于T细胞抗原受体活化的非调节性
T细胞中。最近研究数据表明FOXP3同样表达于一些非淋巴细胞中,并且可以抑制
不同的癌基因。
1.1.1 Foxp3及其在免疫系统的功能
叉头(Forkhead)蛋白是功能多样的转录因子组成的一个大家族。FOX转录因子
最初发现于果蝇中,研究表明现已经有超过100多个叉头转录因子168,691,并且已经作
为脊椎动物的分叉头转录因子的标志。FOX蛋白被分为15类(亚家族),这些转录因
子的分类不是按照其功能而是按照其结构来进行的。每类用一个数字来表示某个基
因。为区分鼠和人的编码转录因子的基因,人的全用大写字母表示(FOx);而鼠的
仅第一个字母大写(Fox)。核转录因子Foxp3是一段长49kDa:至:55kDa的蛋白,是转
录调节器P亚家族成员之一,由高度保守的叉头结构DNA结合区以及其它的功能区构
成,包括C2H2锌指结构和螺旋亮氨酸拉链区构成。对于Foxp3突变的scurfy小鼠以及人
FOXP3突变的IPEX综合症患者而言,这种突变是致命的,这些都证明了FOXP3具有维
持免疫平衡的作用l701。现已证实FOXP3是小鼠体内调节性T细胞发育和功能发挥的必
要充分条件1681。并且已发现Foxp3在CD4+CD25+调节性T细胞中是高表达的,而在
CD4+CD25’T的细胞中异位表达171。731。Foxp3+CD4+CD25+的调节性T细胞的数量和性能
对于预防自身免疫病是至关重要的174,75】。FOXP3可以减弱活化T细胞细胞因子的效应,
并且可以抑制活化细胞的增殖以及周围T细胞的效应功能174。77】。Foxp3通过不同的方式
调节不同谱系的调节性T细胞:1.通过结合不同的转录因子NFAT,NF.KB and Runxl发
挥作用:2.通过DNA结合区与靶基因结合的相互影响;3.通过诱导可调控的MiR.155
发挥作用17引。
1.1.2 Foxp3与肿瘤
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证据表明FOXP3还表达于除了胸腺和脾脏外的其他组织中,最近FOXP3的
mRNA和FOXP3蛋白在一些肿瘤细胞系中被检测出来,并且证实其表达水平与IL-10
及TGF.gl有关179】,最新发表的FOXP3在胰腺癌细胞中的表达为也为此提供了证据,
并且表明这可能是一个重要的肿瘤逃逸机制【删。此外,FOXP3被认为是
HER2/ERBB2癌基因的转录抑制器,并且K可以抑制乳腺癌中的SKP2基因的启动
子18¨,在人乳腺癌中还发现大量突变和缺失的FOXP3,研究表明FOXP3的突变导
致了高自发率的乳腺癌,并且增强了小鼠模型的致癌易感性1821。通过以上发现,
FOXP3被认为是乳腺癌中的一个抑癌基因。然而,在HER2/ERBB2低表达的肿瘤细
胞中,FOXP3同样可以抑制肿瘤细胞的生长及诱导细胞凋亡,从而表明,FOXP3可
能通过多条信号通路发挥作用。
35
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第二章研究目的、方法、实验设计方案和意义
2.1研究目的
探讨含有蛋白穿膜结构域(protein transduction domain,PTD)的小鼠Foxp3
(PTD.mFoxp3)融合蛋白对小鼠T淋巴瘤细胞系EI广4的细胞增殖和凋亡的影响。
2.2研究方法和技术
细胞培养技术、蛋白纯化技术、流式细胞术。
2.3实验方案的设计
Annexin V.FITC和Pl双染流
式细胞术检测EL.4细胞凋亡
2.4研究意义
本课题旨在通过在体外初步探索PTD.Foxp3对EL广4细胞的增殖抑制以及
诱导凋亡作用的机制,本研究的完成将为进一步探讨trI'D—Foxp3在体内的诱导
肿瘤细胞凋亡作用奠定奠定了基础,同时可能为肿瘤治疗提供新的治疗策略。
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第三章实验材料
3.1细胞株
EL广4细胞购自中科院上海细胞所。
3.2实验菌株和质粒
小鼠pET28a.m.Foxp3,pET28a—Foxp3,pET28a—PTD.GFP表达载由本室构建
并保存。
3.3主要试剂
Cell Counting Kit.8(CCK.8,日本同仁化学研究所),新生牛血清(new—born calf
serum,NCS,杭州四季青公司),PRMI 1640培养基(1nvitrogen公司产品),异丙基
.B—D硫代半乳糖苷(Isopropyl B.D.thiogalactoside,IPTG)(德匪]Merk公司产品),纯
化树脂Profinity IMAC镍金属螯合填料(美国Bio.Rad公司产品),BCA蛋白浓度测定
试剂盒(碧云天公司),Annexin V.FITC和Pl双染细胞凋亡检测试剂由江苏大学药学
院高静教授赠送。其余试剂均为进口或国际分析纯。
3.4主要仪器
二氧化碳培养箱(FORMA,美国),低温高速离心机(Eppendorf 5417R)温控
高速离心机(Eppendorf 5810R),核酸/蛋白定量仪(Eppendorf),流式细胞仪
FACSCalibur。
37
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第四章实验方法
4.1融合蛋白的表达纯化
将测序正确的pET28a.PTD—Foxp3、pET28a—Foxp3、pET28a-PTD-GFP融合质粒转
化进入大肠埃希菌Rosetta(DE3),筛选出阳性克隆,增菌,加入IPTG至终浓度为lmM,
30"(2振摇培养4 h后离心收菌,使用含有1 mL Profinity IMAC金属螯合填料的平衡柱纯
化。收集目的蛋白,用BCA蛋白浓度测定试剂盒测其浓度,过滤除菌后立即使用。
4.2 EL.4细胞增殖抑制试验
EL广4细胞培养jf含10%NCS的RPMI.1640培养液中至对数生长期,用新鲜培养液
重悬后,于96孔板中每孔接种4x10S/mLfl]t胞100pL,设置空白、无关蛋白和不含PTD
的Foxp3对照组,分别加入100 pL RPMI.1640培养液、PTD—eGFP和Foxp3融合蛋白,
并使其终浓度为0.64/tM;实验组力HAl00 pL PTD.Foxp3,并使其终浓度分别为0.32pM
和O.64pM;每个蛋白浓度均做3个复孔。将细胞置于37℃,5%C02培养箱中培养20 h
或44 h后,按试剂盒操作说明每孔加入20“L的CCK.8试剂,放入孵箱中继续培养4 h
后,用酶联免疫分析仪,以450 nm为检测波长和650 nm为参比波长测定各孔吸光度值。
本实验重复三次。
4.3流式细胞术检;:91JIEL一4细胞凋亡
EL广4细胞培养于含10%NCS RPMI.1640培养液中至对数生长期,于6jrl,板中每孔
加入2x105/mL细胞lmL,按照细胞增殖试验设组,空白对照组,以等体积培养液代替
融合蛋白,无穿膜肽蛋白对照组加入1 mL Foxp3融合蛋白,并使其终浓度为O.64 pM;
实验组JJI]/入.1 mL PTD—Foxp3,并使其终浓度分别为0.32pM和0.64/tM,每个浓度均做
3个复孑L。将细胞置于37℃,5%C02培养箱中培养24 h后收集细胞,PBS洗涤两遍,
1000 rpm离心5 min,Annexin V.FITC和Pl双染避光染色30 min,过200目筛网,流式
细胞仪检测。本实验重复三次。
4.4统计学处理
采用方差分析法比较组间差异,结果以均数±标准差表示,P<O.05为差异有统计学
意义,P<0.01差异有非常显著意义。
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第五章实验结果与讨论
5.1融合蛋白表达和纯化
纯化的融合蛋白经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定,融合蛋白的浓度分别为:
PTD-Foxp3 800/tg/mL、Foxp3 750/tg/mL、PTD—eGFP 1500/tg/mL,实验时用含10%
NCS RPMI.1640培养液稀释调整至所需浓度。
5.2 PTD.mFoxp3对EL-4_细胞增殖的影响
PTD.Foxp3作用于EL广4细胞后,细胞的生长受到明显的抑制,并在一定范围内呈
现时间依赖性,与各对照组相比均有显著性差异。结果如图1所示,可见与PTD.Foxp3
共育24 h后,高浓度的PTD.Foxp3(0.64/zM)能抑制EL-4细胞的增殖,与各对照组比
较有统计学意义(P<O.05);共育48 h后,两个浓度的PTD.Foxp3(0.32/tM矛1]0.64口M)
均能明显抑制EL广4细胞的增殖(与各对照组比较P分另JJ<0.05和<0.01)。
:0.6
=
I^
2 0.4

o
O.2
2.5
2.O
o
善1.s
-,:
’t
Q 1.0
o
O.S
图1.PTD-Foxp3对EL4细胞增殖的影响(木p<0.05,料p<0.01)
Fig 1.Effect of PTD—Foxp3 on proliferation of EL·4 cells(木p<O.05.宰木p<0.01)
5.3 PTD—mFoxp3对EL一4细胞凋亡的诱导作用
融合蛋白和EL广4细胞共育24 h后,经Annexin V.FITC和Pl双染,流式细胞仪检
测发现:Foxp3(0.64/tM)与空白组无明显差别,有少景细胞发生凋亡,而PTD-Foxp3
(O.32∥M和O.64/tM)能明显诱导EL广4细胞凋亡,凋亡细胞的比例分别为37.83%和
52.21,分别高于Foxp3组23.1 1%矛ti37.49%。


≯扩,、,一∥ 夕∥/2 ∥∥ ,、,/◇,./~r ≯7◇掣
江苏大学硕士学位论丈
H 3 P1’D-Foxp3)qEL-4坌Il|胞捌J、.的影响
Fig 3 Effcct of PTD-Foxp3 on apoptosls of EL-4 cells
5.4讨论
Foxp3足Treg fn特什k0,Ll让的人部分研究是靡中研究儿在Treg帕发育和
功能维持叶]所起的作用ml。肢近,人们研究发现Foxp3贝山抑制肿埔的作用,Foxp3
可以表达J。P皮细胞q,,⋯淹抑制托蚺闶HER.2182l邱SKP21”J:f‘酬抑癌蛙⋯D27、
p21和p53㈨84,851:通过il『l化转求⋯r(activating Iranscrlption factor,ATF)车¨
c—Jun—NH2激酶的激活物曲卉f≮索i anisomycin)可以诱导乳腺癌干u丌常乳腺r应细
』也表达Foxp3,清导肿痛细抛捌r。}“l。¨时也发现1.蛹Foxp3曲:卵巢痛中的表达,
能抑布1t'1,精细胞的埔嫡、迁移年¨侵袭il)jI”】。刚此,Foxp3叮能足抑制肿瘤的天键
性转?五冈子之。木研究试H通过PTD介导外源r}Foxp3诱导肿瘤细胞凋I二,)Aill
达到冶疗刖·痈的¨的。柳步副『究结果表l射,PTD.Foxp3可以强过诱导EL-4细胞棚I、.,
从mJ抑制EL-4圳胞增f=|_i,盯托定范m内14t,t效昔教:j之系。r步,我们将深入研
究PTD.Foxp3的功能,山术术的JIl|l精7iii疗开料新世蹄。
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第六章主要结论及展望
6.1主要结论
本项研究主要通过分子生物学和细胞生物学技术进行了相关的研究,主要结论
如下:
1.成功表达纯化了PTD-Foxp3、Foxp3、PTD—GFP这三种融合蛋白。
2.CCK8细胞增殖实验证实了PTD.Foxp3融合蛋白可以抑制小鼠T淋巴瘤细胞系
EL广4的细胞增殖,并呈明显剂量依赖性。
3.Annexin V.FITC和PI又'2染流式细胞术证实了PTD.Foxp3融合蛋白抑制EL广4细胞
增殖的机制是通过诱导该细胞凋亡。
6.2展望
以上结果显示,我们所表达纯化的PTD.Foxp3融合蛋白具有抑制小鼠T淋巴瘤
细胞系EL4增殖并且诱导该肿瘤细胞凋亡的能力。这些只是初步工作,接下来,我
们将要进行的工作有:深入研究PTD.Foxp3融合蛋白诱导小鼠T淋巴瘤细胞系EI广4
凋亡的机制;观察PTD.Foxp3融合蛋白对其它小鼠来源的肿瘤细胞是否有抑制增殖
及诱导凋亡作用;建立小鼠肿瘤模型,研究融合蛋白对荷瘤小鼠的抑瘤作用;利用
eGFP示踪技术体内观察融合蛋白进入荷瘤小鼠体内,在细胞、组织和器官中的定位
与动力学分布、体内代谢和不良反应等。
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江苏大学硕士学位论文
致谢
在硕士学位论文即将完成之际,向曾经给我帮助和支持的人们表示衷心的
感谢:
首先,我要感谢我的导师邵启祥教授,感谢他三年来在学习和科研方面给
了我大量的指导。他渊博的专业知识,严谨的治学态度,精益求精的工作作风,
诲人不倦的高尚师德,严以律己、宽以待人的崇高风范,朴实无华、平易近人
的人格魅力对我影响深远。我不仅学到了专业的理论知识,掌握了基本的科研
方法,获得了实践的锻炼,还使我明白德教为先,修身为本的道理。在此我衷
心的祝愿他身体健康,家庭幸福。
特别感谢许文荣院长、许化溪教授、王胜军教授、夏圣副教授以及免疫组
的全体老师,感谢他们对本论文的悉心指导,他们严谨治学、实事求是的科研
作风令我钦佩,使我受益良多,在此向他们表示诚挚的感谢。
感谢周红教授、黄新祥教授、钱晖副教授、朱伟老师、陈巧林老师等给予
我热心指导与无私帮助,在此衷心地感谢他们。
感谢班主任毛飞、徐红梅、许潇、申红星老师对研究生工作所做的大量工
作和无私奉献。
感谢我的师兄师姐和师弟师妹们,他们是彭鑫、申卫红、宗扬勇、许逊、
陈勋、田雨香、季宝菊、黄莺、龚文、刘霞、禚娅、邵青、蒋砚秋、高升、顾
益风、孙梦怡以及07届的同学们。在完成此论文过程中他们给予了我莫大的帮
助,我们一起度过的那些多彩快乐的时光将成为我记忆里永恒的画面。
衷心感谢我的父母亲友,他们无微不至的关心和默默的支持是我面对一切
困难考验,积极面对人生的坚实后盾,我所有的一切都可以在他们那里得到理
解与支持,得到谅解和分担。他们是我此生最大的财富。
还有很多我无法一一列举姓名的良师益友,在此一并表示衷心的感谢,他
们的名字我将铭记在心。
最后,衷心感谢在百忙之中抽出时间审阅本论文的专家、教授和参加我论
文答辩的专家教授。
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江苏大学硕士学位论文
攻读硕士学位期间发表的学术论文
1.PTD.mFoxp3融合蛋白对小鼠T淋巴瘤细胞的增殖及细胞凋亡的影响江
苏大学学报(医学版)
2.抗原特异性T细胞活化后Foxp3、CTLA.4及细胞因子mRNA表达水平的动
态分析,免疫学杂志,2010,26(5):416—418
3.两种方式制备的原核表达含吖汀蛋白转导域融合蛋白穿膜能力比较,江苏
大学学报(医学版),2008,18(6):466—471
4.原核表达的含PTD.eGFP不同分子质量融合蛋白穿膜能力的比较,江苏大学
学报(医学版),2009,19(4):286—289